浅谈xy精子分离选性别的方法，电泳筛选法只是其中之一

近几十年来人们对动物的性别控制进行了大量的研究，如与Y精子的分离、鉴定胚胎性别、应用性激素、改变体液酸碱度、食物营养、饲喂不同金属元素、改变生殖道环境、杀死或灭活带某种染色体的精子等。其中，在哺乳动物中主要应用X与Y精子的分离和鉴定胚胎性别的方法。

多年来，人们对X、Y精子之间的某些差异进行了大量研究，并力图利用这些差异来分离不同染色体的精子。

X与Y精子的差别

Y精子的F小体

1968年 Cosperson在研究男性染色体时发现，在Y染色体长臂末端发出有比其他部分强的荧光亮点，并将这些点称为F小体。1970年 Barlow等在Y精子头部发现F小体，且F小体在人和家畜的精子上都能见到。后来经实验反复证明，有F小体的精子一定是Y精子，而没有的则是X精子。

精子的重量

X与Y精子在重量和比重上有差异，主要表现在DNA量的不同。X与Y精子染色体所含DNA不同，X染色体的DNA含量比Y染色体多，重量和体积也大。两者的DNA含量差异一般在3%~5%之间，如牛为3.9%、绒鼠为7.5%。由于重量和比重的不同，而致X和Y精子在液体中运动力、沉降速度等的不同。

精子运动

Y精子的活动能力比X精子强，运动速度快，在含血清蛋白的稀释液中呈直线运动。Y精子尾部膜电荷较多，而X精子头部膜电荷较多。

精子的耐酸碱性

Y精子嗜碱性，而X精子则嗜酸性。

精子表面的H-Y抗原及分布

H-Y抗原即雄性特异性次要组织相容性抗原( male specific minor histocompatibility-Y antigen)，是一种弱抗原，只有Y精子才能表达H-Y抗原。其分布也依精子的来源不同而有差异，附睾头分离的精子H-Y抗原主要分布于靠近精子的尾部，附睾尾分离的精子H-Y抗原主要分布在顶体后端。

尽管对X、Y精子的差异已经进行了大量的工作，但是除了X、Y精子的DNA含量具有明显的差异外，其他方面的差异表现甚微，还经常由于各种环境条件的不同而产生变化，需要继续深入开展研究，为发展新的精子分离技术提供理论基础。

XY精子分离方法

沉降法

根据X、Y精子在体积和重量上的差别，利用具有一定黏稠度的分离液对精子进行沉淀分离，上层主要为Y精子，下层主要为X精子。沉降法虽然有一定的效果，但试验结果不稳定。

离心沉降法

由于X精子的DNA含量高于Y精子，导致X精子的密度及重量大于Y精子，在离心时X精子的沉降速度快于Y精子，下层液体中X精子的含量可大大提高。此方法的优点是分离时间比般沉淀分离短得多，并对精子的活力影响较小。但是X精子间沉降速度的差异有时会比X与Y精子间的差异还大，因此，分离结果很不稳定。

电泳法

依据X、Y精子表面膜电荷的不同，通过电泳时X、Y精子在电场中向不同电极移动而达到分离的目的。 Mobri等(1986)用自由电泳法处理人的精液时发现，在ph7.4时，阳极侧多为X精子，阴极侧多为Y精子(80%)。 Engelmannl等(1988)用此方法却得到与此完全相反的结果。在许多研究报告中，采用多种形式的电泳分离但其结论不一致，分离结果也不稳定。该方法还有待进一步研究和改进。

免疫学分离法

该方法是利用H-Y抗体检测精子质膜上存在的H-Y抗原，以此来分离X精子和Y精子。由于H-Y抗原极弱，对细胞表面H-Y抗原进行血清学和免疫学的检测效果最初并不理想。随着生产高效价H-Y抗体方法的发展，应用H-Y抗体兔疫学亲和柱层析才成功地分离了人和小鼠的H-Y阳性和阴性精子，利用H-Y抗原进行动物性别的控制的研究取得了实质性进展。 Bryant将人和小鼠精液采用H-Y抗血清免疫过滤亲和柱进行精子分离，富集到的人Y精子80%~90%为阳性，富集的小鼠Y精子80%为阳性，富集后的X精子70%为阴性。Zavos将富集后的兔精子受精后雌性为78.19%，牛的精子受精后雌性达74.14%，将6头公牛精液处理后给50头超排母牛受精，结果在195个胚胎中有103个为雌性，占81.11%，对分离后的精液给492头母牛受精后，在187头活犊中，雌性占65.12%，罗承浩等采用H-Y抗血清IgG作用乳牛精液，受精后获81.18%的雌性犊牛。Jones等采用一种免疫磁力方法，其X精子纯度达到98%，从上述结果看，采用H-Y抗原的免疫方法分离X、Y精子是一种较有前景的分离方法，可获得高纯度的X、Y精子群，但该方法存在着对Y精子的损伤问题。

流式细胞分离法

流式细胞分离法是根据X、Y精子上DNA含量的微小差别，通过流式细胞仪（folw cytometer)进行分离，并可同时测定X、Y精子DNA含量的微小差异，进行分离时，首先将精子稀释并与荧光染料 Hoechst33342共同培养，这种染料可以定量地与DNA结合，精子通过检测仪时被激光束激发，由于X精子比Y精子含较多的DNA，X精子放射出较强的荧光信号，放射出的信号通过仪器和计算机系统扩增，分析并分辨X精子Y精子。当含有精子的缓冲液离开激光系统时，借助于颤动的流动室将垂直流下的液柱变成微小的液滴。与此同时，含有单个精子的液滴被充上正电荷或负电荷，并借助两块各自带正电或负电的偏斜板，把X或Y精子分别引导到2个收管中。

流式细胞分离法开创了精子分离的新局面，Johson等用该方法分离的兔Y精子输精后，预测雄性兔比例为81%，实际得到的比例也是81%；X精子输精后预测雄兔的比例为14%，实际产雄兔的比例为6%。Abeydeera等利用该法分离的猪X精子授精，产雌性23头，雄性1头，准确率为97%；利用分离的Y精子投精，产雄性仔猪率高达100%。目前对活的精子分离时，由于核的朝向不一致，加之尾部的影，而不能充分地对所有精子准确地进行区别和分离。另外，还存在分离速度慢和时间较长的问题，分离后的精子活率也受到一定影响，受胎率有所降低。但是，这是当前精子分离方法中最新的也是分离纯度较高的一种方法，如果结合显微注射技术，流式细胞分离法将成为有效的分离X、Y精子的技术而被广泛应用于胚胎工程的研究与实践。

化学药品处理法

该方法根据X、Y精子嗜酸碱性的不同，通过使用化学试剂预先处理阴道，改变生殖道的pH，从而达到选择性利用精子控制动物性别的目的。黑木常青在输精前20~30min注入某一浓度的精氨酸液1ml，结果注入高浓度和中浓度的牛产公犊的多，注入低浓度的产母犊的多。唐正飞用碱性饲料饲喂兔子并在交配前将碱性溶液注入阴道，所生仔兔中雄性比例达到64%~77%。从生产实用性看，如果能用控制生殖道的pH来控制性别，那将具有重要的意义。